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Jurkat,Clone E6-1細胞☆然泰☆人T**細胞白血病細胞細胞培養(yǎng)過程:復(fù)蘇、換液、傳代、凍存 1、復(fù)蘇 (1)取適量培養(yǎng)液加入離心管中; (2)將凍存的細胞在37℃水浴中快速使其融化; (3)將細胞吸入離心管中,1000r.min-1離心5 min,倒去上清液,規(guī)定加入培養(yǎng)液,打勻,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中,即可。 2、換液 (1)將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉,余液用棉花蘸掉; (2)用PBS洗滌培養(yǎng)瓶(從**細胞的一側(cè)倒掉) (3)加入新鮮培養(yǎng)液,即可。 3、傳代(細胞生長得較滿、較好,分瓶后至少培養(yǎng)兩天后再鋪板) (1)將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉; (2)用PBS洗滌培養(yǎng)瓶(細胞一側(cè)); (3)加入2 mL胰酶,靜置,待細胞將脫落時,倒掉胰酶,加入培養(yǎng)液,打勻后,分至多個瓶中。 4、凍存 (1)將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉; (2)用PBS洗滌培養(yǎng)瓶(細胞一側(cè)); (3)加入胰酶,靜置,待細胞將脫落時,倒掉胰酶(可不倒),加入適量培養(yǎng)液,將貼壁細胞吹落,吸入到離心管中,1000r.min-1×5min,倒掉上清液,加入900uL新生牛血清(營養(yǎng)來源)和100 uLDMSO(保護劑)打勻后,吸到凍存管中,密封,于-80℃凍存。 1.預(yù)先配制凍存液:10 % DMSO + 90%胎牛血清,4℃冰箱保存預(yù)冷; 2.用胰酶對細胞進行消化:倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基或用槍小心吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,PBS沖洗兩次,用胰酶消化細胞(盡可能溫和); 3.再次用完培養(yǎng)液懸浮細胞,將預(yù)冷的凍存液加入消化完的細胞中,用滴管輕輕吹打混勻。 4.在每支凍存管中加入1ml細胞液, 密封后標記凍存細胞名稱和凍存日期。 5.凍存步驟的細致直接關(guān)系到細胞復(fù)蘇時的活力,如果有程序降溫器(放在-80℃冰箱過夜,放入液氮罐);或者可以在4℃,2h;然后轉(zhuǎn)到-20℃,2h;-80℃,2h;放入液氮罐。 細胞復(fù)蘇 1. 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。 2. 從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻; 3. 離心, 1000rpm,5min; 4. 棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調(diào)整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng); 5. 次日*換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。 鋪板(逐個鋪板,減少污染,鋪板時濃度由低到高) (1)將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉; (2)用PBS洗滌培養(yǎng)瓶(細胞一側(cè)); (3)加胰酶2 mL,細胞將脫落時倒掉胰酶,加培養(yǎng)基少許,打勻(吹開),1000r.min-1×3min,倒掉上清液,加入培養(yǎng)液(一般10mL,根據(jù)細胞數(shù)和鋪板數(shù)量),打勻(可用刻度吸管打勻,注意棉花塞);(4)取100uL/每孔,加入到96孔板上(5000-8000個/孔)。 鋪板注:(1)邊緣孔一般不加細胞,僅加PBS,為*止“邊緣效應(yīng)”引起的數(shù)據(jù)不合理, (2)加藥和的均需加Cell(原料藥SPD,先用少量DMSO溶解,再加細胞 培養(yǎng)液稀釋到所需體積,即只加培養(yǎng)液)。 96孔板12×8,周邊填滿,中間為60。 計數(shù): 計數(shù)板先用水洗后,再用75%乙醇洗,待其干后再用。 用取液槍取適量溶液加入到計數(shù)板上,顯微鏡下觀察計數(shù)(個數(shù)×104/mL) 流式細胞儀流程: 1、基本操作: (1)、收集細胞:胰酶消化各孔(6孔板),收集到離心管,離心得沉淀; (2)、用PBS打勻,洗1-2遍,離心,沉淀; (3)、沉淀的細胞中加入500uL緩沖液,得懸液; (4)、加5uL AnnexinV-FITC(細胞凋亡檢測試劑盒),混勻; (5)、5uLPI混勻; (4)-(6)三組需要避光操作! (6)、流式細胞儀測定。(4×105/孔,6孔板,2mL/孔) 若**天流式測量,可加5—10mL70%乙醇,在4℃固定8h以上。 2、制備細胞凋亡單染管: (1)、活細胞 (2)、一半活細胞+一半死細胞(高溫滅活-水浴90℃)+FITC(染色活Cell) (3)、一半活細胞+一半死細胞+PI(PI-碘化丙啶染色核酸,但不能穿透細胞膜即染色死Cell) (4)、一半活細胞+一半死細胞+FITC(堿性環(huán)境與抗體蛋白反應(yīng),主要是與賴氨酸的氨基與熒光素的硫碳胺鍵結(jié)合,形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合)+PI PBS的配制:(1000mL) NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g、 KH2PO4 0.2 g 、Na2HPO4.12H2O 2.9 g 加超*水至1000mL高壓蒸汽**,4℃儲存,備用。 細胞器具清洗: 瓶、管等+潔消精(過夜12 h),自來水沖洗25遍,蒸餾水沖1-2遍,蒸餾水泡過夜12 h,烘干,高壓蒸汽**(約2 h),再烘干,至少2-3天,方可用。 MTT溶液的配制: MTT濃度為5 mg/mL,溶于PBS或*酚紅的培養(yǎng)基中,用0.22 um濾膜過濾以除去溶液里的**,放4℃避光保存即可。 注:(1)在酶標儀檢測結(jié)果時,為實驗結(jié)果的線性,MTT吸光度在0-0.7范圍; (2)MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配,過濾后4℃,避光保存2周**,或保存在-20℃長期保存;避免**凍融,小劑量分裝,用避光袋、錫箔紙包裹;一般把MTT粉分裝在EP管,再現(xiàn)用現(xiàn)配,當(dāng)MTT變?yōu)榛?*時*不能再用; (3)MTT致癌,用時帶透明薄膜手套。
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